Вестерн-блоттинг — золотой стандарт для обнаружения и характеристики белков. В основном его используют для идентификации конкретного белка в сложной смеси, ведь метод позволяет определить его молекулярную массу. Также он известен как белковый иммуноблот, так как для специфического обнаружения искомого белка используются антитела.
Метод был предложен в 1979 году группой ученых из Швейцарии (Г. Таубин, Т. Стехлин, Дж. Гордон). «Западное» название ему было дано несколько позднее, в 1981 году, У. Нейлом Барнеттом по аналогии с саузерн-блоттингом — методом для изучения ДНК, который был назван в честь разработавшего его британского ученого Эдвина Саузерна. Существуют еще и нозерн-блоттинг для определения РНК, и истерн-блоттинг для характеристики пострансляционных модификаций белков — ни одна сторона света не осталась без внимания молекулярных биологов.
Методика проведения вестерн-блоттинга состоит из нескольких этапов: разделение белков по размеру, перенос на твердую подложку и идентификация целевого белка [1].
1) Белки в составе изучаемого образца разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. На этом этапе под воздействием электрического поля белки мигрируют в геле и разделяются по размеру и заряду. Если на этом этапе провести окраску геля, они будут визуализироваться в виде набора полос.
2) Далее белки переносятся на твердую подложку, обычно на мембрану из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (ПВДФ), также под воздействием электрического поля. Данный процесс как раз и называется блоттингом. Во время этой процедуры гель и мембрану помещают в устройство для переноса между двумя листами фильтровальной бумаги. При этом белки на мембране сохраняют свои относительные положения, полосы расположены так же, как в геле. Часто после переноса проводят окрашивание общего белка красителями, например кумасси R-250, Понсо S или другими, для контроля успешности переноса.
3) Чтобы предотвратить неспецифическое связывание первичных и вторичных антител с мембраной, проводят блокирование мембраны. В большинстве случаев для этого используют обезжиренное сухое молоко или раствор бычьего сывороточного альбумина. Кроме того, существует множество коммерческих блокирующих буферов.
4) Наконец, мембрану инкубируют с первичным антителом, специфичным в отношении искомого белка. А потом добавляют меченые вторичные антитела, специфичные к первичным антителам, что позволяет косвенно визуализировать изучаемый белок. Как правило, вторичные антитела ковалентно соединены с ферментами (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза), которые образуют окрашенный осадок при взаимодействии с хромогенным субстратом. В результате на мембране можно увидеть видимую цветную полосу в том месте, где первичное антитело связано с белком, и определить его молекулярную массу.
1 view
3259
983
3 months ago 00:01:28 1
Вестерн Блот
8 months ago 00:14:34 1
Academia is BROKEN! - Stanford President Scandal Explained
10 months ago 00:08:43 1
Milton Friedman on Slavery and Colonization
11 months ago 00:12:40 1
Western Blot Protocol
11 months ago 00:00:59 1
1990-07-08 worst in worst of all (Guru Puja, Avignon, France)
11 months ago 00:40:14 1
CO NAM SZKODZI? NAWYKI, JEDZENIE, GLUTEN, ALERGIE Czy KAWA? Ryszard Grzebyk
1 year ago 01:39:10 1
The last Wagon 1956. HD ⭐⭐Full Length Western Movies⭐⭐
1 year ago 00:03:06 49
western blot de Pfizer - sonia_elijah - OracleFilmsUK- 4 05 2023 .mp4
2 years ago 00:07:05 1
The Secrets of Codon table
2 years ago 00:05:56 1
Transcription vs. Translation
2 years ago 00:07:32 1
Western vs Southern vs Northen blots - mnemonic technique to memorize
2 years ago 00:13:28 4
Лекция 9. Молекулярно-генетические методы исследования и их применение в медицине.
3 years ago 00:02:56 118
Dr. Amandha Dawn Vollmer:“You keep using this word “isolation“ but I don’t think you know what it means“
3 years ago 00:26:47 1
“Вестерн-блоттинг“ Заседание СНК от
3 years ago 00:34:40 2
OREGON Instagram Ответы на вопросы
3 years ago 00:14:51 1
Western blot COVID-19
4 years ago 00:10:56 1
Western Blotting (Immunoblotting) : Principle and Complete Procedure Explained ! (FL-Immuno/81)
4 years ago 00:21:06 1
Starting with Fluorescent Western Blotting
5 years ago 00:02:07 1
Simplify your Western Blot Workflow with Simple Western
5 years ago 00:03:58 1
4 situations where Flow Cytometry can help | CST Tech Tips
5 years ago 00:09:57 1
Western Blotting
5 years ago 00:00:19 11
Introducing…. Invitrogen HRP Antibody
5 years ago 00:02:33 15
Система гель-документирования Invitrogen iBright FL1500